胚胎冷冻技术在人辅助生殖领域具有重要作用。传统的程序化冷冻在临床已使用20余年，虽经不断改进，解冻存活率仍在70%左右。玻璃化冷冻技术具有简单、快速、效率高等优点，现已广泛应用于人卵子和囊胚的冷冻保存。玻璃化方法冷冻人卵裂期胚胎的报道也逐渐增多。
影响冻融胚胎移植结局的因素很多，包括患者年龄、冷冻胚胎的质量、内膜准备方式等。复苏后胚胎的体外培养时间也是影响冻融胚胎移植结局的因素之一
本研究应用玻璃化法冷冻人卵裂期胚胎，观察胚胎复苏后当日移植或培养至次日移植对妊娠结局的影响。
资料与方法
一、研究对象
2007年1月至2008年6月间，本中心开展的玻璃化法卵裂期冻融胚胎移植共340例，选择其中解冻胚胎数1～3枚，解冻胚胎全部存活(此处的存活标准为无卵裂球溶解，即卵裂球全部存活)，并全部移植的274例进行本研究，其中D2胚胎163例，D3胚胎111例。按胚胎复苏后当日或次日移植分别将D2和D3胚胎分为两组，A组为复苏后当日移植组，B组为复苏后孵育至次日移植组。患者年龄22～49岁。
二、冷冻胚胎来源
采用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a，达菲林，法国)长方案降调或Cetrotide(Serono，瑞士)加人绒毛膜促性腺激素(hCG，Gonal F，Serono，瑞士)和人绝经期促性腺激素(HMG，丽珠制药)进行超促排卵或来曲唑轻刺激方案促排卵。取卵、体外受精、胚胎培养按本中心常规进行，胚胎龄为D2或D3时行新鲜胚胎移植，移植后所有不进行囊胚培养的剩余胚胎进行玻璃化冷冻。胚胎评分按本中心常规进行，将Ⅰ级和Ⅱ二级胚胎定义为优质胚胎⑺。
三、玻璃化冷冻和复苏
1.冷冻液、解冻液和冷冻载体：冷冻液、解冻液和冷冻载体均本科自制，冷冻载体为自制冷冻片(strawtop，由0.25 ml冷冻麦管制成)。冷冻液由3种液体组成，即基础液、平衡液和玻璃化液。基础液是含20%SSS拟人输卵管液(mHTF，Irvine，美国)，平衡液(equilibration solution，ES)由含7.5%EG+7.5%二甲亚砜(DMSO)的基础液构成，玻璃化液(vitrification solution，VS)由含15%EG+15%DMSO+0.58 mol/L蔗糖的基础液构成。EG、DMSO和蔗糖(Sigma，美国)。解冻液由含蔗糖的20%SSS—mHTF构成，蔗糖浓度递减，分别为O.83，0.42和0 mol/L。
2.冷冻方法：胚胎由生长液滴转至冷冻基础液2 min，再在ES中平衡适当时间后移入Vs，迅速装载至冷冻片Strawtop，直接投入液氮冻存。胚胎在ES的平衡时间依据卵裂球的体积恢复确定，一般以卵裂球体积恢复至冷冻前为平衡充分。胚胎自移入Vs到投入液氮的时间一般控制在45 sec左右，不超过1 min。冷冻过程在室温(22～25℃)下进行。
3.解冻方法：解冻前预温解冻1液(含O.83 mol/L蔗糖的20%SSS—mHTF)至37℃，解冻2、3、4液于室温(22～25℃)中平衡。装载有胚胎的Strawtop自液氮中取出后迅速移人解冻1液，停留1 min后顺序移入解冻2、3、4液，分别停留3、5、5 min。
四、内膜准备和胚胎移植
内膜准备主要有自然周期、激素替代和HMG促排卵周期3种方式，按本中心常规进行[7]。移植时，在超声监测下使用胚胎移植管作胚胎官腔内移植。胚胎移植后14 d进行尿hCG定性检测，检查阳性者2周后行阴道超声检查，发现宫内孕囊者判定为临床妊娠。
五、统计分析
统计分析采用SAS6.12软件。统计检验主要采用t检验及卡方检验。P
结 果
一、患者年龄、人均移植胚胎数和胚胎质量比较
D2和D3胚胎解冻后当日移植和次日移植两组(A组和B组)的患者年龄、人均移植胚胎数和解冻胚胎的质量(优质胚胎率)均无统计学差异(P>0.05,表1)。
二、两组内膜准备方式比较
D2和D3胚胎解冻后当日移植和次日移植两组(A组和B组)的内膜准备方式均无统计学差异(P>O.05，表2)。
三、当日移植和次日移植与妊娠结局的关系 D2和D3胚胎解冻后当日移植和次日移植两组(A组和B组)的临床妊娠率、种植率和流产率均无统计学差异(P>0.05，表3)。
四、玻璃化冷冻时胚胎龄与妊娠结局的关系 玻璃化冷冻移植周期中，D3胚胎的临床妊娠率和种植率显著高于D2胚胎(P均0.05，表4)。
讨 论
随着体外受精一胚胎移植及其衍生技术的不断发展，胚胎冷冻技术已常规应用于人类辅助生殖领域。将剩余胚胎或因各种原因不在刺激周期移植的胚胎进行冷冻保存，大限度地使用胚胎，减少了多胎妊娠、卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimu-lation syndrome，OHSS)等不良结果的发生。
传统的程序化冷冻在临床已使用20余年，虽经不断改进，解冻存活率仍在70%左右。1985年，Rall和Fahy⑻首次报道了玻璃化法成功冷冻小鼠8细胞期胚胎，为玻璃化冷冻应用于临床奠定了基础。随后，玻璃化冷冻广泛应用于囊胚期胚胎的冷冻，获得了满意的效果。因人囊胚培养比较困难，常规进行囊胚培养和囊胚冷冻仍不是大多数中心的做法，所以，积极开展并推广卵裂期胚胎玻璃化冷冻的临床应用具有重要意义。
影响冻融胚胎移植结局的因素，包括患者年龄、冷冻胚胎的质量、内膜准备方式等等⑼。复苏后胚胎的体外培养时间也是影响冻融胚胎移植结局的因素之一，通常复苏后的胚胎在体外培养2～3 h进行宫腔内移植，但叶英辉等⑸认为延长复苏后胚胎的体外培养时间，并进一步观察胚胎分裂情况而进行移植胚胎的选择，可能有助于提高移植妊娠率。李志强等⑹的结果则提示，次日移植并不能提高临床妊娠率和种植率，而增加了流产率。二者均针对程序化冷冻进行研究，得出的结论却不尽相同，原因可能有二：其一，二者的样本量较小，前者28例，后者100例，增加样本量可能会得出更加客观和科学的结果;其二，前者的研究中，存活胚胎数多于移植胚胎数，延长体外培养时间是为了选择具有更佳发育潜能的胚胎移植，此时得到的结论已不仅是体外培养时间与妊娠结局的关系，而更多的体现于胚胎质量与妊娠结局的关系。
本研究分别将D2和D3胚胎分为当日移植(A组)和次日移植(B组)，两组的患者年龄、人均移植胚胎数、胚胎质量和内膜准备方式均无统计学差异。为了更客观的探讨体外培养时间与妊娠结局之间的关系，选择的冻融胚胎移植周期还具有以下特点：解冻胚胎数不超过3枚，解冻胚胎全部存活并全部移植，且存活胚胎无卵裂球溶解，所以次日移植组不存在对移植胚胎进行选择，仅仅是延长了体外培养的时间。结果两组临床妊娠率、种植率和流产率无统计学差异。该研究结果对人IVF临床工作具有以下指导意义：(1)延长玻璃化冻融胚胎的体外培养时间并不显著影响胚胎的发育潜能;(2)为了减少胚胎实验室的工作量，一般不建议延长解冻胚胎的体外培养时间;(3)当存活的胚胎数多于需要移植的胚胎数，且不易作胚胎选择时，可以考虑培养至次日选择继续卵裂、质量更好的胚胎用于移植;(4)在充分考虑子宫内膜与胚胎发育同步的前提下，可灵活选择移植当日解冻或移植前一日解冻，这既方便了患者，又增加了胚胎实验室在工作安排上的灵活性。
程序化法冷冻胚胎移植周期中，胚胎发育阶段对妊娠结局的影响观点不一。salumets等⑽认为，与D2胚胎相比，D3胚胎的解冻存活率低而流产率高，但Sifer等⑾妇的结果却提示，D2和D3胚胎的解冻存活率无显著差异，而D3胚胎具有更高的妊娠率、种植率和活胎分娩率。目前，玻璃化冷冻中，卵裂期胚胎不同发育阶段(D2或D3)对妊娠结局是否有影响尚无资料报道，我们的结果显示，与D2胚胎相比，D3胚胎具有更高的妊娠率和种植率，而二者的流产率无显著差异。需要注意的是，该结果尚不能单纯理解为玻璃化冷冻中D3胚胎比D2胚胎受到的冷冻损伤更小，具有更好的发育潜能.这还可能与本中心的新鲜胚胎移植策略和胚胎冷冻策略有关。当患者的可用胚胎数少于3～5枚时.一般在D2行新鲜胚胎移植，剩余胚胎当日(D2)冷冻.而可用胚胎数多于5枚时，则一般在D3行新鲜胚眙移植，剩余胚胎当日(D3)冷冻。玻璃化冷冻中，胚胎发育阶段对妊娠结局的影响，需要进一步研究。
本研究B组50个周期共解冻120枚胚胎，其中有4个周期的8枚胚胎未继续卵裂。移植后有2例临床妊娠，分别种植1枚胚胎，但都以流产告终。提示延长培养时间并观察其继续分裂能力可能有助于预测其发育潜能，即未继续卵裂的胚胎即便种植了，其结局也未必良好，但该数据的样本量太小，我们将继续积累病例，对此作进一步观察。
